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scientific research
bsRNA-seq (m5C RNA甲基化测序)
m5C修饰

RNA上目前发现存在着170多种不同类型的转录后修饰,并且所有已知的RNA种类都可以被修饰,其中rRNA和tRNA的修饰最多。mRNA上的主要修饰类型包括m6A、m1A和m5C。m5C修饰是最早发现的RNA修饰之一,最初研究表明主要分布在tRNA和rRNA上,近期研究表明,真核生物的mRNA上也存在m5C修饰,其可以维持mRNA的结构和稳定性、调控翻译过程等。与m6A修饰类似,对m5C进行研究同样绕不开催化/擦除m5C修饰的修饰酶(Writers)/去修饰酶(Erasers),以及各种阅读器蛋白(Readers),已经有研究证明具有m5C修饰的mRNA的命运可以由m5C修饰的reader蛋白调节,而且在某些病理情况下,可以使mRNA的m5C修饰水平错误调节。

Writers:

·NSUN2是大部分mRNA和非编码RNA上的m5C修饰的催化酶;

·NSUN家族其余成员行使各自的催化酶功能,具体如下表;

·DNMT2主要负责真核生物天冬氨酸(Asp)tRNAm5C修饰的催化酶,修饰主要发生在反密码子环中的C38处;

·TRM4A/TRM4B是在植物拟南芥中鉴定出的催化酶。

Erasers:

·TET1/TET2/TET3主要负责mRNA去甲基化酶;

·ALKBH1功能见下表;

Readers:

·ALYREF和YBX1均负责识别mRNA上的m5C修饰。

 

 

 

 

bsRNA-seq

与DNA的BS-seq类似,bsRNA-seq利用重亚硫酸盐处理时,会发生脱氨基反应,最终从胞嘧啶(C)转换成尿嘧啶(U);如果胞嘧啶发生了m5C甲基化修饰,这个转换则无法发生,处理之后仍然是胞嘧啶。通过上述原理,对富集后的RNA进行重亚硫酸盐转换,建库和高通量测序,通过对测序Reads中C-T转换进行分析,即可在单碱基分辨率上检测所有mRNA甲基化修饰的状态

 

 

bsRNA-seq的实验原理如下图所示:首先通过polyA捕获mRNA,或者通过rRNA剔除去掉rRNA,然后将获得的RNA进行BS处理;对处理后的RNA进行文库构建、高通量测序和生物信息学分析,通过C-T转换以单碱基分辨率鉴定出m5C修饰的位点。

 

 

由于rRNA中含有m5C修饰,因此实验过程中rRNA的剔除是必需的。目前存在两类技术去除rRNA的干扰,一种是polyA捕获正筛mRNA、另一种是rRNA剔除负筛rRNA,这两种方法成本上存在着巨大的差异,同时其检测对象和结果也显著不同:

mRNA捕获:便宜,但仅能对mRNA和部分带有polyA尾的lncRNA上的m5C修饰进行研究,是目前最常用的方法;

rRNA剔除:贵,且受物种限制(参考这里),但该方法可以全面检测mRNA、lncRNA、circRNA和pre-mRNA上的m5C修饰,是非常全面的方法;

 

服务流程

您只需要提供足量的组织/细胞或RNA,我们将根据物种、RNA起始量为您推荐合适的bsRNA-seq实验方案~

 

方法对比

实测数据

m5CmRNA上的分布

目前mRNA的m5C修饰研究还相对较少,人、小鼠等m5C修饰分布在mRNA的5’UTR、CDS和3’UTR区域,而且在start codon处有特异性peak;拟南芥中主要分布在CDS和3’UTR区域,而且在stop codon处有特异性peak,因此m5C修饰的分布具有物种特异性。

 

 m5C修饰在mRNA原件上分布图 

 

甲基化模式分布图

 

甲基化C碱基序列特征分析

文章解析

拟南芥中的RNA m5C甲基化修饰

m5C是一种研究较为深入的DNA修饰方式,并且主要报道见于原核与真核的ncRNA中。然而,在植物mRNA中m5C的分布与功能仍并不被人所知。在这项研究中通过m5C-RIP-seq技术研究了拟南芥中m5C RNA的全基因组特征。

首先通过LC-MS/MS和Dot blot分析对拟南芥m5C的整体特征进行鉴定,m5C修饰在各种RNA中均存在,且在mRNA的修饰占高比例;m5C修饰在各组织中也普遍存在,且在角果中占高比例;随着发育的进行,m5C修饰比例逐渐增加(下图C, E)。

 

 

随后通过m5C-RIP-seq对拟南芥幼苗进行全转录组的m5C分析,得到6045个m5C peaks,并通过m5C-RIP-qPCR进行验证测序结果(下图D)。RNA-seq数据和m5C-RIP-seq数据联合分析表明,无论是高表达还是低表达的转录本均能发现m5C的修饰(下图C)。

 

通过体外的实验证实TRM4B是RNA m5C修饰的甲基转移酶。取tum4b突变株进行m5C-RIP-seq,m5C的特征与前述正常拟南芥测序相一致,但是m5C修饰明显减少(下图A-H)。

       

参考文献:

Cui X, Liang Z, Shen L, et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana.[J].Molecular Plant, 2017, 10:1387.