对于一线临床科研人员来说，一方面大部分的精力需要放在临床上，科研的时间很有限，同时对于机制研究所需的复杂实验技术又不熟悉，这是劣势；另一方面长期的临床工作又可以积累大量的临床样本，这是其他基础科研工作者难以接触到的资源，是巨大的优势。因此我们要做的就是找到一种方式，充分利用手中的资源优势、同时避开时间和技术上的劣势，作出漂亮并有价值的工作。本期文献解读给大家带来的就是这样一个思路简单、手段简单，但意义很大的一篇文章。

研究背景和待解决的科学问题

生物标志物的研究历来是临床研究的一个非常重要的领域。鉴定出一个特异性和普遍性都很高的标志物，对于疾病的诊断、治疗都具有巨大的推动作用，临床意义巨大。生物标志物的研究是紧随生命科学的研究进展而发展的，从早期的蛋白质、到后期的SNV、基因表达pattern、miRNA，每一种新发现的分子都具备标志物的潜能。环状RNA被发现以来，由于其高度的稳定性，已经成为诊断标志物的明星分子。本文就是希望在肺癌中鉴定有标志物潜能的环状RNA分子。

实验设计

生物标志物的研究思路非常简单，本文的鉴定队列设置了10个肺癌患者的配对的癌组织和癌旁组织，肺腺癌和肺鳞癌各五例。并扩大样本数目作为验证队列，如下表所示。

结果和主要发现

一、circRNA特征描述

对鉴定队列的10例共20个样本进行circRNA-seq之后，首先进行了常规的分析，对鉴定出的cicrRNA数目、长度分布、外显子使用等基本信息进行了描述，总结如下：

1.共鉴定出了17952个circRNA，其中98.84%的circRNA有至少两个反向剪接序列（back-spliced reads）支持。

2.有60.8%的宿主基因可以产生至少两种circRNA；

3.约77.4%的circRNA含有2-5个外显子；

4.筛选出的circRNA约有91.7%的长度在200-1200个核苷酸；

二、差异circRNA分析和潜在标志circRNA的筛选。

接下来作者对2种癌症类型癌组织和癌旁组织差异的circRNA进行了鉴定，发现：

1.在肺腺癌癌组织和癌旁组织中，筛选出50个差异circRNA；

2.在肺鳞癌癌组织和癌旁组织中，筛选出172个显著差异circRNA；

3.在两种癌症中共同差异的circRNA有26个；

接下来作者对筛选出来的circRNA进行了进一步的挑选，并使用验证队列来检测这些circRNA差异的普遍性和特异性。作者的目的是为了筛选出肺腺癌和肺鳞癌特异的circRNA，并筛选出可以作为这两种癌症公共标志物的circRNA，因此在上述3组中挑选了表达量最高的circRNA进行验证：

1.hsa_circ_0001073在肺腺癌中差异显著；

2.hsa_circ_0001495在鳞状细胞癌中差异显著；

3.hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821则在两种癌组织中都有显著差异。

hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495在qPCR验证结果与二代测序结果一致，前者在肺腺癌中显著下调，后者只在鳞状细胞癌中有高表达。且差异在人群中极显著，说明这2个circRNA具备分别作为肺腺癌和肺鳞癌标志物的潜质；

针对在两种癌组织中共同差异的hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821，作者设计引物使用qPCR在67个非小细胞肺癌患者的组织中进行qPCR验证，结果显示hsa_circ_0077837显著上调，hsa_circ_0001821显著下调，与鉴定队列的结果一致；且差异在人群中极显著，说明可能是2个有价值的肺癌标志物；

最后，这些经过验证的差异circRNA是否能作为非小细胞肺癌诊断的生物分子标记？作者对检测样品进行了ROC曲线分析，结果显示：

1.hsa_circ_0077837和hsa_circ_0001821可以作为检测非小细胞肺癌的生物标记，不能作为区分肺腺癌和鳞状细胞癌的生物标记；

2.hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495可以分别作为生物标记来预测肺腺癌和鳞状细胞癌。

总结

       这是一篇典型的且成功的分子标志物研究的文章。如果相关领域没有类似报道，并且手中又具备丰富的样本库，那么就可以进行这样的尝试。并且，思路可以拓宽到其他的新型分子中，如lncRNA、miRNA、RNA甲基化位点等等等等。本文的一大缺憾是没有将环状RNA稳定性极高的优势发挥出来：由于circRNA稳定性很强，因此在外周血中可以稳定存在。本文通过组织鉴定出来的circRNA，如果在血液中不能被检测到，实际上是没有诊断价值的。因此一个好的思路应该增加这些患者手术前、手术后的血液样品，对这些circRNA在血液中的存在与否、浓度进行检测，就是一个完整的标志物研究的工作了。