CircRNA是一种新型的非编码RNA，也是最近RNA领域的研究热点之一，其表达具有一定的组织和疾病特异性。已有研究表明，circRNA可以作为miRNA海绵来调控基因的表达，在细胞分化、神经发育和疾病发生方面发挥着重要作用。在肿瘤方面，已有文章显示circRNA在一些肿瘤的发生与增殖有着重要的调控作用。
本期我们将介绍一篇研究胆囊癌中circRNA调控机制的文章，该文章不仅阐述了circRNA在癌症恶化中的调控作用，同时还论述了circRNA对基因表达调控的新的调控机制。
虽然circRNA在肿瘤中的调控作用已经有很多报道，但在胆囊癌的发生与增殖过程中，circRNA尚无研究，因此，本文目的为找到与胆囊癌发生与增殖相关的circRNA，并对其机制进行研究。
针对实验目的，作者做了如下研究：
一、在胆囊癌的发生与增殖过程中，是否有circRNA在其中发挥调控作用？
1. 为了寻找circRNA的表达差异，本文取了10组胆囊癌癌组织和癌旁组织做RNA-seq，对其中的circRNA进行鉴定和分析，得到如下结论：
① 在样品中共鉴定出48304个circRNA候选，有大于95%的circRNA表达量很低（BRPM＜1），2542个circRNA在5个以上的胆囊癌组织和癌旁组织中都能检测到，且有较高的表达；
② circRNA在胆囊癌和癌旁组织中的表达模式显著不同，仅有20%左右的候选circRNA在两组组织中均含有，说明在胆囊癌的发生和增殖中，circRNA的表达有很大的改变。同时，相比于癌旁组织，癌组织circRNA的表达水平普遍下降；同时在circRNA的种类方面，癌组织约 5610.8 ± 1493.4种，同样少于癌旁组织的6397.9 ± 1507.4种，这与已有研究一致。该结果说明，circRNA很有可能在胆囊癌的发生与增殖过程中发挥作用。
③ 已有的研究表明，circRNA的产生有RNA的反向剪接产生，反向剪接由顺式元件和反式因子调控。理论上讲，反向可变剪接和经典可变剪接之间会存在竞争，从而导致circRNA与同源mRNA之间的表达负相关。但本实验的数据显示有很多circRNA与其同源mRNA的表达存在正相关，因此需要对这一现象是如何产生的进行分析。
本文分析了483个与同源mRNA显著相关的circRNA，其中大部分circRNA与它们的同源mRNA呈正相关，只有40个是负相关。此外，同一基因座产生的circRNA表达水平往往呈正相关。作者从该结果推测，在胆囊癌组织中circRNA表达水平主要是由转录时pre-mRNA总量改变来调控，而不是由剪接水平上的调控引起。
文中对比胆囊癌组织和癌旁组织发现，在胆囊癌发展过程中，与癌旁组织相比，胆囊癌组织的circRNA与其同源mRNA表达的相关性显著增强。同样的，与癌旁组织相比，来自同一基因座的circRNA在胆囊癌组织中表达水平之间的相关性也有所增加。 这些结果表明，circRNA的调节更依赖于胆囊癌组织中基因组转录的调节。
2. 在确定了胆囊癌形成与增殖过程中circRNA的表达特点后，需要找到合适的circRNA来对该表达模式进行验证
基于此目的，作者分析了2582个高表达的circRNA中的131个差异表达显著的circRNA，其中中有62个在胆囊癌组织中显著增加，69个circRNA显著减少。
作者选取了12个差异最显著的circRNA进行深入研究，通过PCR引物验证与RNase R消解，得到了8个circRNA候选，将这些circRNA在29对癌组织和癌旁组织中进行了qPCR验证，验证结果大致与RNA-seq的BRPM值一致，其中circDNAH14–1, circDOCK1–1, circEPB41L2–1和circERBB2达到了qPCR差异显著性的指标，且circERBB2的显著性最明显，且有报道显示其同源mRNA是胆囊癌中最重要的驱动基因之一。因此，作者选取circERBB2作为候选研究circRNA在胆囊癌发生及发展过程中的机制。
二、 在胆囊癌的发生与增殖过程中circERBB2有哪些功能？
作者设计了两种反向剪接序列的靶向siRNA来沉默胆囊癌细胞（SGC-996；GBC-SD）的circERBB2表达：
使用circERBB2沉默细胞和对照细胞，通过CCK8化验检测胆囊癌细胞活性、circERBB2细胞定位（FISH）、RNA pull down检测circERBB2结合蛋白及其结合蛋白的RIP实验和双荧光素报告酶实验、circERBB2作用蛋白的co-IP及细胞亚定位等实验来寻找并验证circERBB2的功能。
① CCK8化验表明沉默胆囊癌细胞（SGC-996；GBC-SD ）circERBB2表达会降低癌细胞的增殖活性；同时在体内实验中，当circERBB2被沉默后，相比于对照组，胆囊癌移植瘤明显变小，当circERBB2被过表达后，对移植瘤的生长有促进作用。由此证明，circERBB2在体内和体外都促进了胆囊癌细胞的生长。
② 虽然circERBB2有miRNA海绵体的作用，但其潜在的靶miRNA在功能方面与胆囊癌的增殖并不相关，无法解释circERBB2对胆囊癌细胞增殖促进作用的机制。
作者又用FISH实验对circERBB2进行了定位，发现与其他circRNA不同，circERBB2主要定位于细胞核内的核仁区，与其pre-mRNA具有相似的亚细胞定位。而核仁区是核糖体合成的主要场所，已有研究表明，癌细胞恶性增殖需要异常快速的rRNA合成。两者结合，作者推测circERBB2有可能通过调控rRNA的合成来促进胆囊癌细胞的增殖。
在此假设下，作者对比了胆囊癌细胞和沉默circERBB2后的癌细胞的45S,18S, 28S和 5S rRNA含量，发现沉默circERBB2后的癌细胞的45S表达水平显著降低，说明circERBB2与rDNA的转录有关。双荧光素报告酶的实验也表明在circERBB2沉默后rDNA的启动子活性显著降低，而在将circERBB2过表达后又显著增加。综合结果推测circERBB2通过上调核仁中的Pol I活性和rDNA转录来促进GBC的增殖。
为了验证circERBB2的功能，作者对293 T细胞做了circERBB2过表达处理，将293T细胞作为对照，将两者的Total RNA用DNA探针捕获circERBB2后进行了RNA pull down实验，发现过表达组的蛋白富集高于对照组，通过MS检测了富集的蛋白，从中筛选出与调节rDNA转录，rRNA加工和细胞增殖密切相关的PA2G4蛋白。
本文通过PA2G4蛋白的RIP实验证明进一步验证了PA2G4与circERBB2的结合，在PA2G4的结合RNA中，circERBB2会被PA2G4显著富集，又在28个GBC组织与癌旁组织中进行了蛋白丰度的检测，发现PA2G4的p48异构体在癌组织中显著增加，表明在PA2G4可能在GBC中起致癌基因的作用。
同时，对SGC-996细胞进行PA2G4沉默后的qPCR和双荧光素报告酶实验都显示45S rRNA含量和rDNA启动子的活性都显著降低，说明PA2G4同circERBB2一样对rDNA的转录是必不可少的。有报道曾指出，在T细胞中，TIFIA是Pol I活性和rDNA转录的关键调节因子，PA2G4通过与TIFIA相互作用来调节rDNA转录。本文对两种蛋白进行了定位实验发现它们在核仁区存在明显的共定位，证明PA2G4是胆囊癌中TIFIA活性的重要调控因子。
实验发现circERBB2的过表达显著增加了Pol I与TIFIA的相互作用，而circERBB2的敲除则降低了两者的相互作用，而circERBB2与PA2G4直接结合，PA2G4又与TIFIA结合，这些发现表明，circERBB2-PA2G4-TIFIA复合物在GBC细胞中上调Pol I活性、rDNA转录和细胞增殖中起重要作用。
三、circERBB2调控PA2G4的方式和其对胆囊癌的发生与增殖影响的机制是什么，如何评价其临床意义。
当circERBB2敲除后，细胞中PA2G4的总量没有明显变化，但IF实验显示，当circERBB2敲除后，PA2G4在核仁的定位却显著减少。 同样的，qPCR显示，circERBB2敲除后的SGC-996细胞的核仁区PA2G4表达显著降低；单独提取细胞核后的PA2G4蛋白含量也明显降低，这些结果表明circERBB2调控了PA2G4的核仁定位。当SGC-996细胞在无血清培养基中培养时，PA2G4在核仁区的定位也显著降低，表明PA2G4在核仁区的定位与细胞增殖相关。由于rDNA的转录发生在核仁区，本文推测PA2G4在核仁区的定位是其调控rDNA转录的基础。
为了证实这一推测，本文构建了PA2G4过表达载体（PA2G4-mCherry-Flag）和PA2G4mut载体（PA2G4mut-mCherry-Flag），前者定位在核仁区后者主要定位在细胞质中，将这两组载体转入内源PA2G4沉默的SGC-996细胞中后，发现PA2G4-mCherry-Flag转入的细胞中45S rRNA的表达水平显著增加，证实了PA2G4通过在核仁的定位调控rDNA转录的假设。
最后，为了评价circERBB2对胆囊癌患者预后的临床意义，文章使用含有149例经手术切除的胆囊癌原代标本的组织进行FISH分析，结果显示，circERBB2高表达的病人存活时间短于低表达病人。
结语
在本文中，作者从胆囊癌组织与癌旁组织的差异circRNA入手，通过综合利用RNA-seq，FISH、RNA pull down、RIP等circRNA常用的研究手段，全面地阐述了在胆囊癌组织中，circERBB2通过circERBB2-PA2G4- TIFIA上调Pol I活性、rDNA转录和胆囊癌的增殖的机制，为胆囊癌找到了新的治疗靶点。
同时，不局限于已有研究结论是本文最大的亮点，在研究过程中，研究方向的确定始终以客观的实验数据为出发点，首先做出科学的推测，然后通过严谨的实验加以证明，最后各种成果水到渠成，这是我们在科学研究中最值得借鉴的地方，随着生命科学的快速发展，已有研究的各种认知都可能随时被完善或颠覆。
