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Science：表观遗传真的很重要
2020-08-21 下载

表观遗传学一直都是生命科学研究领域的研究热点，今天小编跟大家分享一篇利用多组学联合分析表观遗传相关基因功能的文章。这篇文章发表于2020年8月5日的Science杂志上，文章使用ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq、sgRNA-seq等多项前沿测序技术，阐述了表观遗传关键蛋白的相关因子Phf19对造血干细胞分化能力的影响，里面的故事也有一点波折，下面让我们一睹为快吧~

 

 

研究背景和要解决的科学问题

PcG蛋白复合物是表观遗传过程中主要的调控因子，PRC2是构成PcG的核心蛋白，PRC2能通过H3K27me3修饰来影响染色质的开放性抑制基因表达。而PRC2相关因子Phf19能通过识别甲基化的组蛋白及招募PRC2复合物到靶基因发挥作用，影响组蛋白甲基化状态和转录后基因沉默。
本文作者所挑选的Phf19基因就是属于这个庞大的表观遗传调节因子群体的一部分，甚至Phf19已经被研究了30多年，而本文的研究与前作相比，又有哪些新的发现呢？

有研究显示PRC2在造血系统中发挥了重要作用，造血干细胞（HSCs）是成人骨髓中少见的还保持分化成所有血细胞类型的多能干细胞，而表观遗传修饰也是影响HSCs分化能力中重要的一环。本文就是通过多种实验手段证实了Phf19能通过表观遗传修饰影响机体长期造血。

 

实验设计和结果解读

1. Phf19基因缺失小鼠模型

 实验的第一步还是熟悉的构建基因缺失小鼠，所以接下来就是当然是看看缺失小鼠的表型、造血干细胞组成有哪些变化了，结果如下：
  • Phf19缺失（Phf19-KO）的年轻（8-12周龄）小鼠除部分肋骨出现异常外，大部分器官没有显著变化（下图F）；成年（＞60周）Phf19-KO小鼠出现脾肿大（下图G）；对照组（Phf19-Flox）小鼠表型无异常；
  • 对Phf19-KO/Flox小鼠胚胎胎肝和8周龄小鼠骨髓中造血系统的细胞组成进行比较，发现Phf19-KO小鼠胎肝中造血干细胞增加，8周龄Phf19-KO小鼠中HSCs和LSK细胞减少（下图A）；

  • 分别将8周龄Phf19-KO/Flox的全骨髓细胞移植至野生型小鼠，同时与同源野生型小鼠的全骨髓细胞进行竞争性细胞移植，每三个月进行一次移植实验，结果发现：移植50万个细胞，Phf19-KO/Flox组在造血系统上的贡献无差异；接着作者将移植的细胞量提高到100万，在第三次移植后才出现差异，并且Phf19-KO移植组细胞在造血中的贡献显著下降（下图E）。（在这里不得不佩服作者的毅力，这种不做出来不罢休的劲头让人折服）。

     

 

以上结果也能看出来，Phf19基因缺失对小鼠并不致命， Phf19-KO小鼠在胚胎期的造血系统缺陷也并不明显（甚至HSCs细胞量还增加了），成年期Phf19-KO小鼠存在一定程度上的贫血症状。那么造成Phf19-KO小鼠长期供血能力下降的原因是什么呢？

 

2.Phf19-KO小鼠HSCs增殖和分化能力

作者首先确定了骨髓造血干细胞水平降低是否是由于机体稳态环境下长期低效率造血所引起。作者使用了不同的压力条件对小鼠进行刺激。
结果发现：在应激条件下，Phf19-KO小鼠的减少的HSCs得到补偿。
这说明Phf19-KO造血干细胞能够在应激条件下增殖，既然排除了增殖能力的缺陷，那么，血液系统长期供血能力降低可能与HSCs分化缺陷相关。

 

所以接下来作者就通过单细胞培养对HSCs分裂和分化能力进行了验证，按细胞在96孔板上的增殖情况分为，持续增殖，不增殖，增殖后停止三种情况。结果如下：

  • Phf19-Flox和Phf19-KO小鼠的绝大部分都是持续增殖孔，Phf19-KO小鼠的持续增殖孔数目显著多于Phf19-Flox小鼠，并且这些孔的细胞量也多于Phf19-Flox小鼠（下图C）；
  • 对细胞表面的marker对HSCs的分化能力进行鉴定，结果显示，Phf19-KO小鼠分化能力受损（下图D）。

这里的结果就和前面的数据对上了，与对照组相比，Phf19-KO小鼠的HSCs具有更高的增殖能力，但分化能力降低。

 

 

3.Phf19-KO小鼠HSCs基因表达的变化及影响

 那我们怎么确定Phf19缺失影响造血系统的具体机制和通路呢？先做一个RNA-seq看看吧。
  • GO分析显示，相较于Phf19-Flox组，Phf19-KO组维A酸类以及核受体显著上调，生物合成和能量产生通路显著下调。这与静止期造血干细胞特征极为相似（下图C）；
  • GSEA对特定的基因集进行分析，Phf19-KO组的HSCs特征基因富集程度显著高于Phf19-Flox组（下图A）；Phf19-KO组中与HSCs分化必需的的Myc基因网络显著下调（下图B）；
  • 通路富集分析显示生物合成途径例如核糖体和mRNA加工通路下调，正调控维A酸通路集上调（下图C）。

综合转录组的数据，同样证实Phf19-KO组HSCs细胞大部分处于静止状态，并且在此状态下细胞的分化能力下降。

 

 

Phf19能招募PRC2，而PRC2能通过H3K27me3修饰来影响染色质的开放性抑制基因表达。那么敲除Phf19是否会影响导致H3K27me3修饰水平呢？那么转录下调是否是由于组蛋白修饰以及染色质开放性影响的结果呢？

 

4.组蛋白和染色质开放性的变化

 作者通过ChIP-seq和ATAC-seq进行了验证：

  • ChIP-seq初始的结果有点出乎意料，相较于对照组，Phf19-KO组的H3K27me3水平显著更高（作者甚至还用RNA-seq的结果进行定量质控）。

     

 

这时候作者就要想想是为什么了。前面转录组GSEA的结果显示，Phf19-KO组静止期的HSCs的特征基因富集程度是高于Phf19-Flox组的，因此作者推测，Phf19-KO细胞中H3K27me3水平升高可能与这此相关。结果证实：

  • 虽然Phf19-KO组整体的H3K27me3水平升高，但是与HSC静止期相关的特征基因上，两组之间无明显差异（下图D左）；而分化相关的基因以及其转录因子H3K27me3水平显著升高（下图D中，D右）；

  • ATAC-seq也证实与分化相关的转录因子染色质开放性显著降低（下图E）。

 

从以上结果也可以看出，Phf19-KO组H3K27me3水平升高与分化基因相关，并且分化基因及其转录因子染色质开放性降低，说明Phf19-KO对HSC静止期相关的特征基因无显著影响，但是与HSC分化相关基因表达受到抑制。

 

 

虽然ATAC证实了富含H3K27me3区域的染色质开放性降低，但是染色质变化相关对分化相关基因的影响是怎样的呢？

 作者使用单细胞RNA-seq（MARSseq）和体外强制分化实验对此进行了检验：
  • 相较于对照组，Phf19-KO组小鼠的转录本使用模式相关性更强（下图F）；（造血干细胞具有分化成多种细胞的能力，其本身的异质性相对比较高的）
  • Phf19-KO组中，包含这些差异基因的细胞显著减少（下图G）；

  • 体外分化实验检测分化相关转录因子的表达，结果显示除Cebpa外，其他的转录因子的mRNA表达均下降，这与动物实验中Phf19-KO小鼠HSCs的髓系分化增强是一致的。

     

综合以上数据可以看出，PHF19的缺失会导致HSCs的表观遗传修饰发生改变，导致可分化相关过程受到抑制，引起HSCs的髓系分化增强。
 
总结
虽然作者挑选的是一个已经被研究多年的基因，并且其发挥作用的机制也被研究得比较透彻（主要是与各种癌症相关），就算是这样，作者也硬生生找到一个小的新方向。小编以前看到说，只要收集到有足够生物学意义的样品，获取其过程中表观遗传学的变化这样的文章比较容易发，确实没骗人呀。本文作者也使用了多项热门技术支撑自己的实验结果，利用这些工具也能帮助大家顺利发表文章。

 

参考文献：

Vizán, P., Gutiérrez, A., Espejo, I., García-Montolio, M., Lange, M., Carretero, A., . . . Di Croce, L. (2020). The Polycomb-associated factor PHF19 controls hematopoietic stem cell state and differentiation. Science Advances, 6(32), eabb2745. doi:10.1126/sciadv.abb2745

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