本文中使用到的WGBS-seq、ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq以及多组学联合分析，康测科技均可完成！
研究背景和待解决的科学问题
弥漫性内生型桥脑胶质细胞瘤（DIPG）是儿科中一种高致死率、恶性程度非常高的脑干胶质瘤，并且没有有效治疗的手段。前期有研究报道OLIG2转录因子对DIPG细胞系CCHMC-DIPG-1的增殖具有关键作用，但是本文作者意外地发现CC-DIPG-1细胞中的OLIG2表达水平较低，并且展现出间充质细胞表型，那么OLIG2是否真的在DIPG细胞增殖中扮演关键作用值得去研究和证实。
因此，本文要解决的科学问题，就是回答OLIG2是否对DIPG细胞增殖有着至关重要的作用，如果不是，OLIG2的作用是什么？
DIPG是生长在脑中线的肿瘤，无法通过手术切除，对放疗化疗具有抗性。DIPG具有高度的异质性，基因组分析显示大部分DIPG在组蛋白H3.3和H3.1的第27位赖氨酸K突变成甲硫氨酸M（K27M），但是部分肿瘤细胞没有发生突变，也具有野生型的H3.3。另外，PDGFRA基因表达水平的升高与少突胶质细胞前体细胞（Oligodendrocyte Precursor Cell, OPC）增殖有关，这一现象出现在绝大多数DIPG病人中。新生小鼠诱导H3.3 K27向M突变可以导致神经祖细胞向恶性肿瘤细胞转化，成为类似DIPG肿瘤细胞的表型。
基于基因表达模式不同，恶性程度非常高的胶质瘤可以进一步分成3类：
1. 原神经细胞表型；
2. 传统肿瘤细胞表型；
3. 间充质细胞表型。
第一种原神经细胞表型与少突胶质细胞谱系特征相近，特异性表达少突胶质细胞谱系基因（Oligodendrocyte lineage Gene）OLIG2；第二种传统肿瘤细胞表型明显与星形胶质细胞谱系更为接近，特异性表达EGFR；最后一种间充质细胞表型通常与激活状态的YAP1、TGFβ和NFκB信号通路有关。一般认为类干细胞型的神经祖细胞和表达OLIG2的类OPC型祖细胞族群是DIPG肿瘤细胞的起源。
OLIG2已被证实可以在少突胶质细胞谱系发展阶段调控PDGFRA基因的表达，OLIG2也在原始状态的OPC细胞（pri-OPC或pre-OPC）中表达，并且这类细胞在DIPG肿瘤中显示出干细胞的特性。OLIG2可以在原神经细胞表型DIPG肿瘤细胞中检测到较高水平的表达，但是在传统肿瘤细胞表型和间充质细胞表型DIPG肿瘤细胞中表达水平很低甚至没有表达，这说明OLIG2在传统肿瘤细胞表型和间充质细胞表型DIPG肿瘤细胞中的作用并不关键。
2017年一篇文献[1]报道了在CC-DIPG-1细胞系中敲低OLIG2基因可以在体外抑制DIPG细胞的增殖。但是作者在前期的研究中发现CC-DIPG-1细胞中OLIG2表达量极低，并且展现出间充质细胞表型，这和2017年的文献结果相悖。为了证实OLIG2在CC-DIPG-1细胞增殖中的作用有限，并且探究OLIG2表达水平有何影响，作者设置了以下样本组开展研究。
样本设置
研究内容
1. CC-DIPG-1细胞中的OLIG2表达量究竟如何？
作者首先通过qRT-PCR发现OLIG2的mRNA表达水平在CC-DIPG-1细胞中并不高，这与2017年的文献CC-DIPG-1细胞高水平表达OLIG2的报道不符。而其他种类的细胞均高表达OLIG2（见下图）。
为了验证OLIG2的mRNA表达水平，作者又从蛋白水平检测OLIG2的表达情况，结果显示在CC-DIPG-1细胞中OLIG2的蛋白也无法被检测到（见下图）。
作者进一步通过免疫荧光染色验证了OLIG2的蛋白水平以及干细胞特征性转录因子SOX2的蛋白水平（见下图）。前面介绍了高水平表达OLIG2的pri-OPC细胞展示出肿瘤干细胞特性，因此作者在这里发现CC-DIPG-1细胞并没有展现出肿瘤干细胞的特性，而是属于其他肿瘤细胞表型。
2. OLIG2的表达为什么受到抑制？
为了研究OLIG2表达为何受到抑制，作者首先想到OLIG2基因可能受表观调控。表观调控主要由三大类调控模式组成：a. DNA甲基化修饰；b. 组蛋白修饰；c. 染色质构象。
作者首先利用WGBS-seq检测了CC-DIPG-1细胞全基因组DNA甲基化情况。WGBS结果显示，CC-DIPG-1细胞所有CpG岛甲基化模式与另外三种细胞具有显著差异（见下图）。
作者进一步分析发现，CC-DIPG-1细胞的OLIG2和SOX2基因的CpG岛发生高度甲基化（见下图），这说明OLIG2基因的转录水平受到抑制。既然OLIG2基因的CpG岛被高度甲基化，作者自然想到如果移除这些甲基化修饰能否恢复OLIG2基因的表达呢？利用Decitabine去甲基化后，CC-DIPG-1细胞中OLIG2的mRNA水平和蛋白水平均有所升高。
因为DNA高度甲基化会导致染色质构象处于不开放的状态，所以检测完DNA甲基化情况，作者继续检测OLIG2基因染色质构象状态。通过ATAC-seq，作者发现CC-DIPG-1细胞染色质开放程度与CC-DIPG-2明显不同，具体为：相比CC-DIPG-2，CC-DIPG-1细胞的OLIG2和SOX2基因染色质构象均不开放（见下图）。
完成以上两种表观调控检测后，还剩下最后一种表观调控模式：组蛋白修饰。作者当然不会放过这种调控模式，接着进行了H3K27ac ChIP-seq。众所周知，H3K27ac是转录激活型组蛋白修饰，如同作者设想，ChIP-seq结果显示CC-DIPG-2细胞OLIG2和SOX2基因的H3K27ac修饰程度明显高于CC-DIPG-1。
通过三种类型的表观调控检测手段，作者发现CC-DIPG-1细胞的OLIG2和SOX2基因在三种表观调控模式中都处于抑制状态，这解释了OLIG2在CC-DIPG-1细胞中为什么表达水平很低，也初步证明OLIG2基因在CC-DIPG-1细胞中的作用非常有限。这时就引出下一个问题，OLIG2是否真的能影响细胞增殖能力？为了回答这个问题，作者开展了第三部分的研究。
3. OLIG2表达水平对细胞增殖能力是否具有影响？
作者首先想验证2017年文献的结论：OLIG2的缺失会导致CC-DIPG-1细胞增殖受到抑制。通过WST-1细胞增殖生存实验，作者发现低水平表达OLIG2的CC-DIPG-1细胞比高水平表达OLIG2的CC-DIPG-2和SU-DIPG-IV细胞增殖速度更快（见下图），这明显与文献报道不符。
作者进一步排除未敲除完残存的OLIG2蛋白是否对细胞增殖产生影响，因此设计shRNA由慢病毒载体导入CC-DIPG-1细胞，大幅敲低OLIG2的表达，结果发现与敲低对照组Ctrl相比，CC-DIPG-1细胞增殖能力没有发生显著改变（见下图）。
既然敲低OLIG2低水平表达的CC-DIPG-1细胞增殖能力没有发生改变，那么那些OLIG2高水平表达的细胞，敲低OLIG2后是否也不影响细胞的增殖能力呢？作者利用CRISPR-Cas9系统敲除CC-DIPG-2和SU-DIPG-IV细胞中的OLIG2基因，接着进行WST-1细胞增殖生存实验，结果显示敲除OLIG2基因的CC-DIPG-2和SU-DIPG-IV细胞增殖能力也没有发生显著改变（见下图）。
除了体外实验，作者也进行了体内实验。免疫荧光染色结果显示敲除OLIG2基因的CC-DIPG-2和SU-DIPG-IV细胞相比对照，增殖能力并没有发生明显变化（见下图）。
至此，作者已经可以下结论：OLIG2表达水平并不是影响细胞增殖的必要条件。既然OLIG2不影响细胞增殖能力，那它在细胞中的作用是什么呢？带着这个疑问，作者开展了第四部分的研究。
4. OLIG2表达水平是否会影响细胞表型？
完成前三部分的工作，作者对CC-DIPG-1细胞整个表观调控模式有了一定认识，基于CC-DIPG-1细胞和其他细胞表观调控模式的不同，作者可以合理假设CC-DIPG-1细胞的转录组水平肯定也发生了变化。通过RNA-seq，作者发现对比数据库中的神经干细胞（NSC）和其他DIPG细胞，CC-DIPG-1细胞的表达模式完全不同。对比TCGA数据库中恶性胶质母细胞瘤（GBM）的类型发现，CC-DIPG-1细胞的表达模式与GBM中的间充质细胞表型更加相似（见下图）。
除了表达模式相似，前面介绍了恶性胶质细胞瘤可以分为三大类：a. 表达OLIG2的原神经细胞表型；b. 表达EGFR的传统肿瘤细胞表型；c. 与YAP等信号通路有关的间充质细胞表型。根据GSEA的结果，对比CC-DIPG-2细胞，作者发现CC-DIPG-1细胞中的EGFR和YAP通路的信号强度提升（见下图）。
获得了CC-DIPG-1细胞的表达模式，作者进一步从表观调控层面检测了YAP1和EGFR基因的调控状态。在染色质构象水平，ATAC-seq和H3K27ac ChIP-seq结果显示，CC-DIPG-1细胞的YAP1和EGFR基因所处区域的染色质状态比CC-DIPG-2更加开放，并且伴随更高程度的H3K27ac修饰（见下图）。
通过RNA-seq、ATAC-seq和ChIP-seq，作者发现在CC-DIPG-1细胞中，OLIG2和SOX2低水平表达，而YAP1和EGFR高水平表达，辅以这些基因的表观调控状态，这些特征共同证明了CC-DIPG-1细胞与间充质细胞表型更为接近。
确定低水平表达OLIG2的CC-DIPG-1细胞表型，作者接下来将眼光放到高水平表达OLIG2的细胞中，探究OLIG2是否具有改变细胞表型的功能。作者选择SU-DIPG-IV细胞进行OLIG2基因的CRISPR-Cas9敲除。通过RNA-seq发现，OLIG2-KO细胞对比野生型细胞和对照，基因表达模式发生了显著变化，差异上调表达的基因主要集中在HIPPO-YAP、EGFR和TGF-β信号通路中，而差异下调表达的基因集中在与少突胶质细胞表型相关的基因例如SOX10、MYT1等，还有和正常神经胶质以及神经发育相关的基因例如SLC1A1、SORCS3等（见下图）。这说明OLIG2-KO细胞的表型发生了改变，那么具体转化成哪一种表型？
作者接着把传统肿瘤细胞表型和间充质细胞表型的标志基因分别设成基因集，通过GSEA分析发现OLIG2-KO细胞在传统肿瘤细胞表型标志基因集的富集程度更高，而不是间充质细胞表型。这些结果共同说明OLIG2的缺失改变了DIPG细胞的表型，使其从原神经细胞表型向传统肿瘤细胞表型转化。
至此，作者已经回答了开头的问题：OLIG2的表达水平对于DIPG细胞的增殖不是必要条件；OLIG2的表达水平的高低影响DIPG细胞的表型。
总结
- 作者发现CC-DIPG-1细胞中OLIG2的表达水平不高，与之前文献报道不符；
- 通过qRT-PCR验证CC-DIPG-1细胞中OLIG2的表达水平很低；
- 利用WGBS-seq、ATAC-seq和ChIP-seq等手段，表明三种表观调控模式中，CC-DIPG-1细胞OLIG2基因的表达均被抑制；
- 细胞增殖生存实验显示低表达水平的OLIG2并不会使CC-DIPG-1细胞增殖能力受到抑制；
- 表观调控模式的变化必然带来表达模式的变化，通过RNA-seq确定CC-DIPG-1细胞的表达模式与间充质细胞更接近；
- 再次通过ATAC-seq和ChIP-seq确认间充质细胞表型相关基因YAP1和EGFR处于表观调控的激活状态；
- 利用CRISPR-Cas9敲除高水平表达OLIG2细胞的OLIG2后，导致DIPG细胞从原神经细胞表型向传统肿瘤细胞表型转化。
这篇文献最有趣的地方在于，发现自己的实验数据跟之前的文献报道不一致之后，作者并没有怀疑自己而裹足不前，反而大胆假设、小心求证，不仅确认了自己的数据准确性，甚至推翻了之前文献的论断，得到了新的发现。所以小编觉得，如果经过真的确认自己的实验没有问题，与之前文献相悖之处说不定就是你的大发现哦。
参考文献
- Anderson JL, Muraleedharan R, Oatman N, et al. The transcription factor Olig2 is important for the biology of diffuse intrinsic pontine gliomas. Neuro Oncol. 2017; 19(8):1068-1078.
