采集临床免疫治疗（ICB）响应组与非响应组的肿瘤组织样本，制备单细胞悬液。利用常规 3' 或 5' 短读长单细胞转录组测序（如 10x Genomics Chromium 系统）进行细胞聚类。

• 关键分析逻辑： 计算不同亚群中经典激活指标（如GZMB, PRF1, IFNG）与免疫检查点（如 PDCD1, CD274）的表达丰度。在此基础上，重点筛选基因表达层面无法解释临床响应差异的细胞亚群，例如具有明显免疫激活特征但仍表现治疗耐受的T细胞状态，或具有免疫逃逸特征但经典检查点表达无法解释的肿瘤细胞亚群，并对其进行差异表达基因（DEG）分析，确立其特异性表面标志物（Surface Marker），为后续的分选或靶向富集奠定基础。

• 预期可视化：UMAP细胞分群展示。例图：在发表于 Nature Medicine 的关于肿瘤微环境T细胞状态的研究中，研究者通过 UMAP 图清晰划分了不同功能的 T 细胞亚群。

图源：Nat Med. 2018;24(7):978-985.

针对第一步富集或锁定的“表型矛盾”细胞亚群，利用长读长单细胞测序技术（如 Oxford Nanopore PromethION 平台）进行单细胞全长转录组测序。

• 关键分析逻辑： 摆脱短读长测序对转录本重构的“猜测”，直接读取从5'端到3'端的完整mRNA序列，避免短读长数据依赖转录本拼接推断的局限。重点解析免疫检查点相关基因（如CD274、PDCD1）及其下游调控因子的完整转录本结构，鉴定外显子组合改变、可变启动子使用等Isoform事件，并结合剪接事件定量分析评估其在耐药细胞状态中的特异性富集。

• 预期可视化：基因结构图展示转录本结构，小提琴或箱线图展示表达量。例图：在发表于 Nature Communications 的研究中，研究者围绕 IL32 基因的两个转录本异构体，先用基因结构图展示其外显子组成与长度差异，再用细胞群定位图和小提琴图揭示这两个异构体在 Fibroblasts（PDGFR-α/β+）与 CD8+ T cells 中具有明显的细胞类型特异性表达，并通过统计检验量化了其表达差异。

图源：Nat Commun. 2024;15:6916.

为了避免体外单细胞悬液测序破坏组织原位信息的弊端，需采用高分辨率空间转录组技术。

• 关键分析逻辑： 基于第二步单细胞全长转录组鉴定出的Isoform特异性序列，针对其特有外显子组合或剪接连接区域（splice junction）设计特异性检测探针，并利用Xenium、CosMx等靶向空间转录组平台，实现候选Isoform在组织切片中的空间定位。结合组织形态学信息、病理标注及空间细胞类型解卷积方法，定义肿瘤-免疫交界区域（Tumor-Immune Interface），定量评估异常 Isoform 是否在“两军对垒”的接触面上呈现显著的浓度梯度富集，从而验证候选Isoform是否与免疫逃逸相关的空间微环境特征相伴随。

• 预期可视化：组织切片图展示肿瘤边界，秩排序或者火山图展示转录本表达差异，柱状或气泡图展示差异基因的富集趋势。例图：在发表于 Nature Communications 的肿瘤空间微环境研究中，研究者展示了如何在组织切片上勾勒出肿瘤-免疫边界，并分析基因在边界处的表达和富集趋势。

图源：Nat Commun. 2023;14:933.

建立患者来源肿瘤细胞与自体T细胞共培养体系。

• 关键分析逻辑： 针对第二步和第三步确立的致病性异常 Isoform，设计特异性靶向其剪接位点的反义寡核苷酸（ASO），或者使用 CRISPR-Cas13 等转录本编辑工具。在共培养体系中，通过给药干预，阻断异常 Isoform 的生成，纠正异常剪接模式，恢复正常Isoform比例。随后，利用实时活细胞成像系统（Incucyte）或流式细胞术（FACS），连续检测并定量 T 细胞对肿瘤细胞的实时杀伤率、靶细胞凋亡比例以及杀伤因子的释放水平。进一步通过Isoform特异性过表达或rescue实验，确认候选Isoform对免疫逃逸表型的必要性和充分性。

• 预期可视化：折线图或箱线图展示药物处理的肿瘤细胞有显著变化。例图：在发表于 Cell 的关于药理学调控 RNA 剪接增强抗肿瘤免疫的研究中，研究者利用小鼠肿瘤模型展示了剪接调节剂 indisulam（RBM39 降解剂）对肿瘤生长的抑制作用。经 DMSO 处理的肿瘤细胞在皮下接种后体积持续增长，而经 indisulam 体外预处理（1 μM，96 小时）并洗脱后接种的肿瘤细胞，在免疫健全小鼠体内的生长受到显著抑制。小鼠肿瘤细胞系：B16-F10（黑色素瘤）、MC38（结直肠癌）和 CT26（未分化结直肠癌）。

图源：Cell. 2021;184(15):4032-4047.e31.

很多时候，临床上面临的“表型矛盾”，往往预示着新机制的诞生。

当传统的差异表达分析在免疫耐受样本前“卡壳”时，单细胞全长转录组技术为我们提供了一个新视角——它不仅让我们看到同一基因座下不同 Isoform 的精细分布，更让我们看到了剪接异质性如何通过改变蛋白质构象，在空间组织界面上重塑免疫逃逸。

四步策略核心逻辑很简单：用常规单细胞找矛盾，用长读长测序找变异，用空间组学看原位，用剪接干预做闭环。 它的核心立论在于：肿瘤免疫状态不仅取决于“表达了什么”，更取决于“如何表达”。那些被短读长测序漏掉的剪接细节，恰恰是决定患者对免疫治疗响应差异的关键所在。

明确了这一点，未来的转化路径也就清晰了：一方面，这些特异性剪接异构体可以作为新型的诊断标志物，帮临床精准识别“伪热肿瘤”；另一方面，针对这些关键 Isoform 的剪接调控，也将成为克服临床耐药、与现有 ICB 疗法协同增效的潜在新策略。

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