FFPE样本如何提高WES建库成功率？
FFPE (formalin fixation and paraffin embedding）样本，是用福尔马林固定后用石蜡包埋制成的样本，是临床上保存病理样本的常用方式，包含着十分丰富的临床诊疗信息。但由于其制备过程（甲醛固定、梯度脱水、石蜡包埋等）和保存方式（一般常温保存），从FFPE样本中提取足量、完整性好的DNA或RNA用于高通量测序面临挑战。本期，小编将分享康测科技关于“FFPE样本如何提高WES建库成功率”的项目经验，希望给大家的科研带来帮助。
FFPE样本DNA提取和建库中面临的挑战
1、DNA的完整性：在FFPE样本的制备过程中，组织经福尔马林固定、石蜡包埋时很容易引起DNA的降解损伤，长期的常温储存也会导致核酸进一步降解，因此提取出来的DNA完整性往往不佳，呈现弥散条带，无完整的基因组DNA条带；此外，石蜡切片的厚度经常和病理染色切片保持一致（约5 μm），无完整的细胞厚度容易造成DNA的机械损伤；
2、DNA提取效率低：FFPE样本中的切片在提取过程中需要先进行脱蜡去除样本中的石蜡，然后水化替换脱蜡介质，脱蜡的效率会直接影响后续提取效率；此外，组织使用蛋白酶K消化不彻底也会严重影响DNA释放，导致获得的DNA量较少；
3、DNA建库产出低：由于FFPE样本DNA损伤较为严重，其DNA建库产出可能只有正常DNA样本的20%-60%。
图片实例：FFPE样本提取的DNA电泳结果
针对上述FFPE样本的常见问题，康测科技根据项目经验总结了一些改进方案
一、样本选择与处理
1. 样本质量：优先选择保存时间短、固定和包埋过程规范的FFPE样本。样本应无明显的污染或损伤。
2. 样本切片：蜡块表层的组织样本应先切除5-10片，因为表层的组织样本长时间在空气中裸露无石蜡保护，容易受到污染或降解；切片厚度应适中，通常为5 μm，以确保足够的细胞数量和DNA含量。切片应完整、无破损，避免过薄的切片(< 4 μm)。
3. 脱蜡与消化：彻底脱蜡是提取高质量DNA的关键步骤，推荐使用二甲苯等有机溶剂进行脱蜡。使用蛋白酶K等酶类进行消化，消化条件应该温和，且时间应该充分，但也要避免过度消化导致DNA降解。
二、文库构建与优化
1. 片段化方式选择：FFPE样本DNA提取量通常不高，且DNA本身就存在损伤，机械打断会加剧DNA的物理损伤，因此建议使用酶切法建库；
2. 酶切法建库酶切时间的选择：通常需要将DNA打断到150~200 bp，但FFPE样本往往完整性不高，原始gDNA条带较为弥散；因此推荐酶切时间为常规样本酶切时间的一半，但具体时间还是需要根据所选试剂盒和样本样本具体片段分布来进行调整；
3. 接头浓度选择：FFPE样本DNA完整性差，且DNA存在一定的损伤，因此接头连接效率往往比常规gDNA低，因此相同起始量建库FFPE样本接头使用浓度建议为常规样本的1/2-1/4；
4. 扩增循环数选择：由于DNA模版质量较差，因此建库过程中对比常规样本，扩增循环数建议增加2-3个循环数；
5. WES杂交捕获：由于DNA模版质量不如常规样本，主要体现在文库扩增效率与扩增均一性，若和常规样本等量混库后进行杂交，FFPE文库数据产出远低于常规样本，因此杂交捕获过程中建议将FFPE文库单独进行混库进行杂交捕获；若需要和常规样本进行混库杂交，文库投入量比建议：FFPE文库/常规文库=3/2，但具体的比例还需根据所用试剂盒进行调整。
综上所述，FFPE样本WES建库成功的要点涉及样本选择与处理、DNA提取、文库构建与优化，只有严格按照这些要点进行操作和质量控制，才能确保FFPE样本WES建库的成功率和数据质量。
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