长读长 RNA 测序助力挖掘肾癌复发和免疫逃逸的新基因与转录本
长读长 RNA 测序助力挖掘肾癌复发和免疫逃逸的新基因与转录本
今天解读的这篇文章聚焦于利用长读长RNA测序技术探索肾癌复发和免疫逃逸相关的基因和转录本。研究不仅提供了肾癌研究的宝贵数据，还展示了长读长测序技术，尤其是Nanopore DRS技术的独特优势。
【题目】Long-read RNA sequencing of archival tissues reveals novel genes and transcripts associated with clear cell renal cell carcinoma recurrence and immune evasion
【发表期刊】Genome Research
【发表时间】2024年11月20日
【IF】6.2
一、研究背景：肾癌复发和免疫逃逸的神秘面纱
肾癌作为全球常见癌症之一，其中肾细胞癌（RCC）占比最高，而透明细胞肾细胞癌（ccRCC）又是 RCC 最主要的亚型。大约 30% -50% 的患者在手术切除原发肿瘤后会出现复发转移。肾癌组织中肿瘤浸润免疫细胞比例较高，但遗憾的是，目前对于肾癌复发和免疫逃逸的分子机制尚未完全明确。传统的短读长测序平台在转录组研究中存在诸多局限，比如难以准确重建全长转录本、容易遗漏新型转录本等。而长读长直接 RNA 测序（DRS）和 PCR cDNA 测序（PCS）的出现，为解决这些问题带来了新的希望，但此前二者在临床样本中的应用和对比研究较少。
二、研究方法：DRS和PCS的巧妙应用
研究人员共分析了 12 个原发性 ccRCC 冷冻存档肿瘤样本（6 个来自复发患者，6 个来自未复发患者），利用 Oxford Nanopore Technologies 的 DRS 和 PCS 技术进行测序。通过与 20 名患者的独立队列（10 名复发患者和 10 名未复发患者）的 qRT-PCR 验证，以及对 RCC4 细胞系的 DRS 分析进行对比（图1A）。测序结果显示，DRS 和 PCS 均成功应用于这些存档样本。DRS 生成的读长平均较短（400 - 500 nt），但依然能够提供有价值的信息（图1B-图1C）。两种方法在基因表达谱上具有较高一致性，且都检测到了大量新型基因和转录本。具体来说，DRS 和 PCS 分别识别出 26,457 和 39,115 个基因（图1D），其中有 25,692 个基因是两种方法都识别到的。更值得一提的是，DRS 独家识别出了 765 个基因（图1E），这凸显了 DRS 在基因检测方面的独特优势。
图1
三、关键发现1：ccRCC复发与免疫浸润抑制的关联
通过差异表达基因分析，研究人员发现与未复发肿瘤相比，复发肿瘤中多个关键适应性免疫基因（如 CD8B、PDCD1、GZMK 和 TOX）显著下调（图2A）。使用 ESTIMATE 算法分析发现，复发 ccRCC 肿瘤的免疫评分显著降低（图2B），肿瘤纯度升高，且 CD8+ T 细胞比例显著减少（图2C）。这些结果表明，肿瘤免疫浸润的丧失，尤其是 CD8+ T 细胞的减少，是肾癌复发的一个重要特征。而 DRS 在这一发现过程中发挥了关键作用，它与 PCS 数据高度一致，共同为这一结论提供了坚实证据。
图2
四、关键发现2：新型转录本和基因的挖掘
（一）新型转录本
长读长测序的一个突出优势就是能够发现和定量转录本异构体。研究人员利用 StringTie2 进行转录组组装，发现超过 50% 的组装转录本是新型转录本（图3A）。其中，通过 SQANTI3 分类发现，最显著的转录本类别是完全剪接匹配（full splice match，FSM），占比 36.5%（图3B）。重要的是，这些新型转录本中有相当一部分具有编码潜力（图3C）。
进一步分析发现，在肾癌相关的剪接变体（SVs）中，DRS 和 PCS 能够提供有力证据支持这些 SVs 的存在，并揭示其与特定 UTRs 的共表达模式。例如，在 MVK 和 HPCAL1 基因中，研究人员发现了特定的 ccRCC 相关 SVs，并且这些 SVs 与特定的 UTR 结构相关联（图3D）。这表明长读长测序能够为理解肾癌转录组的复杂性提供独特视角。
（二）新型基因
研究人员还利用 PCS StringTie2 组装鉴定出 1350 个新型基因（图4A），其中大部分为非编码基因（图4B）。这些新型基因在两个测序数据集中都有表达，并且在复发和非复发样本之间存在差异表达情况。特别是一个名为 MSTRG.29728 的新型基因（暂命名为 RECART），在复发 ccRCC 肿瘤中显著上调（图4C），并且通过 qRT-PCR 在两个独立队列中得到了验证。
图4
五、关键发现3：PD-L1新异构体的发现
在免疫检查点蛋白 PD-L1（CD274）的研究中，研究人员发现了一个新型可溶性 PD-L1（sPD-L1）异构体。与已知的 sPD-L1 相比，这个新异构体具有更长的 3′ UTR，稳定性较低（图5A）。通过 qRT-PCR 验证发现，在复发和非复发肿瘤样本中，这个新型 sPD-L1 异构体的表达没有显著差异，但膜结合型 PD-L1（mPD-L1）在复发样本中受到抑制（图5B）。此外，在体外实验中，mPD-L1 对 IFNG 和 TNF 刺激的响应性显著高于 sPD-L1 异构体（图5C）。这一发现对于理解肿瘤免疫逃逸机制以及免疫治疗靶点具有重要意义。
图5
六、DRS的独特优势和应用前景
在整个研究过程中，DRS 的优势得到了充分体现。首先，DRS 不需要进行 PCR 扩增，避免了 PCR 偏倚，能够更真实地反映原始 RNA 的表达情况。其次，DRS 可以直接对 RNA 进行测序，从而能够检测 RNA 的修饰情况（如 m6A 修饰等），这是 PCS 技术所不具备的。此外，DRS 在检测新型基因和转录本方面表现出色，在本研究中成功识别出了一批独特的新型基因和转录本。
随着 Nanopore DRS 技术的不断发展和优化，其在临床样本中的应用将越来越广泛。相信在未来，DRS 将为肿瘤等复杂疾病的诊断、预后和治疗提供更多的创新解决方案。
七、总结
这篇发表在《Genome Research》上的研究，通过巧妙地运用 DRS 和 PCS 技术，深入挖掘了 ccRCC 复发和免疫逃逸相关的新型基因和转录本，在肾癌研究领域取得了重要进展。它不仅为我们揭示了肾癌复发和免疫逃逸的分子机制提供了新的线索，还为未来的精准医学研究和临床应用提供了新的方向。特别是 DRS 技术，在这项研究中大放异彩，展现了其在肿瘤转录组研究中的巨大潜力。让我们一起期待长读长 RNA 测序技术在未来带来更多惊喜吧！
参考文献
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