目前已知的RNA修饰有170多种，大多分布在tRNA和rRNA上。近期研究发现RNA修饰在mRNA表达过程中也发挥着重要的调节作用。

• m6A修饰参与调控mRNA稳定性、mRNA出核、mRNA翻译效率，并影响mRNA可变剪接、加尾和可变多聚腺苷酸化（APA）
• m5C修饰参与调控mRNA剪接、mRNA出核和翻译
• ψ修饰参与调控mRNA稳定性、mRNA剪接，并能间接影响APA

测序过程中修饰碱基和未修饰碱基通过纳米孔时产生的电流特征不同。通过特定软件算法对这些电流信号进行分析，从而鉴定RNA分子上的修饰信息。

• 同时检测m6A和m5C
• 单碱基分辨率
• 转录本水平修饰
• 灵敏度更高

Nanopore DRS的其他分析

对OCI-AML3细胞系样本同时进行Nanopore DRS和meRIP-seq，对两种方法分别鉴定到的m6A位点和基因、位点分布模式、motif进行比较。

Nanopore DRS与meRIP-seq结果高度重合

Nanopore DRS获得更多RNA修饰信息

Nanopore DRS鉴定到更典型的motif

• 位点层面：Nanopore DRS鉴定出更多独有的m6A位点；
• 基因层面：Nanopore DRS结果与meRIP-seq重合度很高；
• motif层面：Nanopore DRS也鉴定出了经典的DRACH motif;
• 修饰位点在RNA上的分布：Nanopore DRS与meRIP-seq具备相似的pattern，在stop codon和3’UTR富集（meRIP-seq在5’UTR同样有富集，是因为抗体无法区分m6A和m6Am，因此包含了m6Am修饰位点）。

Nanopore DRS实测与文献结果对比

A和B. 康测科技实测m5C motif和m5C修饰在RNA功能区分布

C和D. 文献中m5C motif和m5C修饰在RNA功能区分布

Nanopore DRS在检测RNA修饰方面的应用

pre-mRNA 可变剪接可以通过形成提前终止密码子的转录本来调节基因表达水平，这种由可变剪接产生的非编码的转录本统称为无义介导的mRNA 降解（Nonsense-mediated mRNA Decay，NMD）转录本。作者发现秀丽隐杆线虫的 SAM（S-adenosyl-L-methionine）合成酶家族基因在喂食和进食的不同处理，可变剪接产生的转录本发生明显变化（图 A，OP50 处理为添加大肠杆菌食物，Emetime 处理为添加翻译抑制剂，rpl-12 作为对照）。为了验证其可变剪接是否由 m6A 修饰调控，作者首先体外转录 sams-3/sams-4 基因 Intron2 和 Exon3 的 pre-mRNA 序列，并体外表达线虫 METT-10（RNA 甲基化蛋白），将 RNA 和蛋白体外孵育后进行 LC-MS/MS，发现在 SAM 底物存在下，远端 3’ SS 位点 AG 中的 A 碱基发生 m6A甲基化（图 B）。体内进行 meRIP 实验，在 Intron2 的 3’ SS 区域设计引物进行半定量 RT-PCR，结果显示 sams-3、sams-4 和 sams-5 的编码转录本（橙色）耗竭，但所有 NMD 的转录本富集，且 NMD 转录本存在 m6A 修饰（图 C）。最后作者利用 Nanopore DRS 数据确认内源性 SAM 合成酶基因的 NMD 转录本在远端 3’ SS 位点处具有 m6A 修饰（图 D、E），说明 SAM 合成酶基因从编码转录本向 NMD 转录本的剪接选择受 m6A 修饰调控。

参考文献：EMBO J. 2021;40(14):e106434.