Nanopore 原生 DNA 修饰测序是一项快速发展的前沿技术。传统二代测序虽能通过富集或化学处理间接推断碱基修饰，但存在流程复杂、无法在单分子水平直接读取修饰信息等局限。Nanopore 的优势在于读长超长、无需富集或抗体捕获即可直接检测5mC、5hmC、4mC和6mA等修饰，能够在单分子全基因组尺度上获取真实的修饰分布，实现更高的灵敏度与准确性。

本技术原理是利用 DNA 分子穿过纳米孔时产生的电流信号差异，直接反映碱基化学修饰状态。通过原生 DNA 上机测序、结合模型训练和专用算法，可一次性获得序列与修饰的联合信息，无需额外实验步骤。该技术应用广泛，可用于多物种全基因组甲基化图谱绘制、表观遗传变异分析、癌症及发育相关调控研究、微生物修饰谱探测，以 及农业与环境样品的表观遗传学研究。总体而言，Nanopore DNA修饰测序为基础研究与临床转化提供了更直接、更全面的表观遗传分析手段。

项目流程

生物信息学分析

结果展示

• A：全基因组甲基化水平circos图
• B：特征序列
• C：不同样品整体甲基化水平对比
• D：差异甲基化区域(DMR)注释到基因区域

案例解读

已有研究发现DNA 5mC修饰参与棉花的纤维发育，但6mA修饰在棉花中的存在及功能还不清楚。作者分别在授粉的-2、0、5天（DPA），对棉花野生型ZM24和无绒无絮突变体ZM24fl取胚珠组织，进行纳米孔原生全基因组修饰测序。ZM24fl突变体在-2 DPA胚珠中6mA水平显著高于野生型，且6mA差异主要出现在“-2到0 DPA”（纤维启动期），5 DPA后差异消失，表明6mA是早期特异性调控标记（图A）。6mA主要富集于基因间区（intergenic），启动子区次之，基因本体最少（图B）。整合0 DPA vs fl-0 DPA 和 0 DPA vs -2 DPA的差异甲基化数据，Venn图交集筛选到5个6mA调控候选靶基因（图C），综合fl的6mA水平启动子区显著下调（图D）和表达水平显著上调（图E），作者锁定GhMAF1为靶基因。敲除GhMAF1后，其成熟种子基部无绒毛（lint）和短绒（fuzz），纤维总数减少~50%,验证了GhMAF1空间特异性调控的功能（图F）。

参考文献：DOI: 10.1111/nph.70047