总页 ꄲ 表观转录组学 ꄲ ac4C Reda C:T-seq

产品概述

表观转录组学研究RNA上的化学修饰如何动态调控RNA的稳定性、翻译效率、剪接和定位等过程，从而精细调控基因表达。ac4C（N4-乙酰胞苷） 是胞苷N4位发生乙酰化的一种重要RNA修饰，最初在tRNA和rRNA中发现，近年来在mRNA中也被证实广泛存在。ac4C修饰主要由NAT10（N-乙酰转移酶10）催化写入，可被特定阅读蛋白识别，影响mRNA的翻译促进和稳定性。

与m6A等甲基化修饰不同，ac4C引入乙酰基后会改变RNA的碱基配对能力和二级结构，尤其在编码区（CDS）和5'UTR靠近翻译起始位点（TIS）附近富集，能显著提升翻译效率。在发育、应激响应、癌变等过程中，ac4C修饰呈现动态变化。传统抗体富集方法（如acRIP-seq）分辨率有限，而ac4C Reda C:T-seq通过化学还原实现单碱基分辨率的ac4C定位图谱绘制，助力精确解析其在基因表达调控中的功能。

技术原理

ac4C Reda C:T-seq 是基于化学还原的单碱基分辨率ac4C检测技术。其核心原理是利用NaBH₄（硼氢化钠）等还原剂选择性还原ac4C，使其转化为可导致逆转录过程中C→T错配的修饰形式，再通过高通量测序捕捉这些特征突变。

主要实验流程：

1.RNA提取与处理：提取总RNA，并根据研究目的使用poly(A)富集mRNA或进行rRNA剔除。
2.化学还原：用NaBH₄处理RNA，将ac4C还原为四氢胞苷衍生物（或类似结构），这一步是方法的核心，使修饰位点在后续逆转录中易于产生特征突变。同时设置不处理组作为对照。
3.RNA片段化与接头连接：将RNA打断成合适长度，在3'端连接测序接头。
4.逆转录与文库构建：逆转录酶在还原的ac4C位点倾向于掺入非互补碱基（导致C→T突变），随后进行PCR扩增构建测序文库（常用Illumina PE150）。
5.高通量测序与生物信息学分析：测序后比对参考转录组，通过比较还原样本 vs 对照样本中的C→T错配频率进行位点鉴定，量化修饰水平、motif分析及功能注释。

应用场景

ac4C修饰在RNA稳定性、翻译调控和细胞应答中发挥重要作用，ac4C Reda C:T-seq 以单碱基分辨率助力深入研究，其应用场景广泛，尤其适用于需要精确定位和定量的场景。

常见应用包括：

1.发育与分化过程中ac4C修饰动态变化及其对翻译效率的调控；
2.疾病（如肿瘤、病毒感染）前后ac4C修饰谱变化及其介导的基因表达异常（如NAT10靶基因）；
3.特定处理（如应激、药物、NAT10抑制剂）前后ac4C位点变化及其功能机制；
4.ac4C与其他RNA修饰（如m6A）的互作研究；
5.鉴定ac4C主导的翻译调控元件和关键调控蛋白功能；
6.新型ac4C位点鉴定及与疾病/表型关联分析。

ac4C Reda C:T-seq 作为高分辨率表观转录组研究工具，常与acRIP-seq、RNA-seq、核糖体图谱（Ribo-seq）以及蛋白质组学数据联合使用，提供从修饰定位到功能输出的完整调控网络洞见。

文献案例：在绝经后的骨质疏松症（PMOP）患者及卵巢切除（OVX）小鼠模型（模拟PMOP）的股骨组织中，ac4C修饰水平及其催化酶NAT10的表达均显著升高，该研究阐明Nat10介导的ac4C修饰如何通过调控下游靶基因，加剧破骨细胞生成，从而驱动PMOP的骨丢失。发现：NAT10敲除后细胞的ac4C修饰整体减少了超过50%；与acRIP-seq数据交叉验证，锁定核心靶点Nfatc1。