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如何检测MRD？

        循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测是识别MRD的主要方法之一。ctDNA在肿瘤细胞死亡时从肿瘤细胞中释放出来，在血液中半衰期约为数小时。因此它可以用作治疗后是否存在残留的癌细胞的实时指标。

        ctDNA用于MRD检测已经在多个癌种中进行了大量的临床研究，其用于MRD检测的价值已经得到充分验证。目前在结肠癌NCCN指南2021.V2版中，认可术后ctDNA检测是I-III期结肠癌复发的标志物。在2021年的《肺癌分子（微小）残留病灶（MRD）的检测和临床应用共识》中，也首次认可ctDNA高通量测序作为肺癌MRD检测的标准。

        ctDNA是肿瘤细胞释放到外周血的DNA，其含量和肿瘤进展息息相关。在肿瘤发生早期以及复发早期，肿瘤组织很小，释放的ctDNA含量在万分之一（0.01%）左右。NCCN指南要求稳定检出含量≥0.02%的ctDNA，因此需要非常灵敏的检测方法。

        另外，克隆性造血（CHIP）会产生大量的低频突变。CHIP随着年龄的增长而增加，这些低频突变会造成很多假阳性的检测结果，影响MRD的判断。因此ctDNA检测中必须去除克隆性造血引入的突变。

MRD ctDNA检测的难点

MRD：微小病灶残留检测

ctDNA

MRD检测的技术路线：组织先验+个性化位点检测 vs 固定Panel检测

        MRD主要有两大类技术路线：Tumor Informed（先验组织）和Tumor Agnostic（无需组织）。前者首先对患者的肿瘤组织进行检测，获取肿瘤中的体细胞突变位点，再针对性的在ctDNA中检测这些位点（通常20个左右）；后者则是无需患者的肿瘤组织和突变信息，直接在ctDNA中检测预设的数十到数百个位点。后者无需组织的固定Panel MRD存在天然的缺陷：

组织先验的优势

1、每个个体肿瘤都有自己特异的突变谱，除少数“热点基因”外，个体之间相同的突变位点极少。如Circulate-Japan项目通过统计400个患者的突变谱系，发现只有1.6%的突变在5个人及以上共有，而超过75%的突变都是患者特异的（右图上）。因此固定Panel虽然基因数目多，但应用到个体上，覆盖的基因数目很少。如右表Guardant360检测了70多个基因，但平均每个患者仅覆盖到了3个。这可能会产生假阴性，无法检测到患者的MRD。

2、与组织先验，针对性的检测患者特异的少数位点比，固定Panel检测的基因数目很多，因此在经济范围内，固定Panel的测序深度较低，通常只有几千x，这在检测万分位含量的ctDNA时是不够的，这也是导致其产生假阴性的另一个重要原因。

综合以上两方面的原因，固定Panel检测MRD，虽然有不依赖组织、可以直接检测血液的优势，但其检测的灵敏度不够，容易造成漏检。如下表，使用固定Panel的Guardant360检测术前ctDNA阳性率只有47%，远低于个性化位点检测的Signetra（88.5%）。

数据来源：JAMA oncology, 2019；J Hematology & Oncology, 2021； Clinical Cancer Reserch, 2021

3、除了检测灵敏度的问题，无组织先验的固定Panel MRD检测，受克隆性造血（CHIP）的影响很大。CHIP是造血干细胞突变分化出的白细胞，这些细胞的DNA存在与血浆中，与ctDNA无法区分。

>组织先验的MRD检测通过肿瘤组织与正常组织筛选体细胞突变选择检测位点，即可将CHIP突变过滤掉。

>固定Panel的MRD检测无法过滤掉CHIP突变，只能通过构建大人群基线或复杂的分析过滤，且仍会造成一定的假阴性与假阳性。

组织先验：WES还是Panel？

组织先验除了部分患者无法获取组织、无法检测外，具有更强的性能优势以及更可靠的临床价值。组织使用全外显子组测序，可以获取到两万多个基因上的外显子上的所有可能突变信息，但这给后续的个性化位点的探针设计、合成带来了巨大的技术难题：针对外显子任意位点设计、合成探针的能力只掌握在少数几个公司手中。因此有部分检测首先使用定制的大Panel（1000多、乃至2000多个基因）对组织进行检测并筛选个性化位点，再使用panel中这些位点的探针对ctDNA进行MRD检测。

这种方法测序深度同样可以达到10万x以上，部分解决了固定Panel测序深度低、敏感性低导致的假阴性问题，但未完全解决位点选取假阴性的问题：1000~2000基因的覆盖区域约1-3Mb，如左表所示，不同癌症DNA突变频率有很大差异，平均约为4个/Mb，使用1-3Mb的覆盖区域，部分肿瘤患者可用的检测位点不足20个。这仍可能由于检测位点不足，导致报告假阴性。

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​Nature. 2007 Mar 8; 446(7132): 153–158.

个性化位点数目：多少合适？

为了提高ctDNA的检出率，就需要降低技术的检测下限（LoD，Limit of Detection），除了采用超高测序深度外，在单突变位点灵敏度固定的条件下，增加检测位点的数目、几率叠加可以提高ctDNA检出的概率。目前不同的技术普遍采用10-50个位点。

那么是不是采用位点越多结果越准确、采用多少位点才是最优的呢？这和检测技术的性能息息相关：在突变位点灵敏度和特异性固定的条件下，增加位点的采用可以增加检测的灵敏度，但同时也提高假阳性率，降低特异性。如右图所示，该技术在是用2个位点作为阈值的条件下，检测位点数目为15个的时候，检测灵敏度接近100%，特异性也接近100%。当检测数目继续增加时，灵敏度没有变化、但特异性开始降低，最终该技术选择16个位点检测。这是由于其突变位点检测的特异性不足（1 SNV cutoff），假阳性率太高导致的。

因此：虽然增加位点可以提高ctDNA的检出率，但在位点特异性较差的情况下，增加位点使用同时会导致检测的特异性变差，结果中存在假阳性。因此提高单位点检测的特异性（亦即准确性：降低假阳性）是关键。

数据来源：Nature, 2017, 545(7655):446-451

灵敏度和特异性：纠错技术

提高MRD检测的灵敏度和特异性的核心，是提高检测技术单突变位点的检测能力。核心就是如何在检测到更低丰度突变的同时，区分真实变异和假阳性变异的能力。这就需要准确的纠错技术。目前MRD检测存在两大类纠错技术：UMI纠错和双链纠错。

UMI纠错：设计了一种标记，在扩增前对每个不同的DNA分子添加不同的标记，检测过程中同一个DNA复制出来的所有DNA分子都带有相同标记。因此在分析过程中，通过UMI标记将同一个DNA复制出来的所有分子，聚集在一起统一分析，真实突变应该存在于含有该UMI的绝大多数、乃至每个分子中，而扩增错误和测序错误则是零散分布的。通过这种方式，我们就可以将扩增错误和测序错误去除掉。UMI纠错只能去除测序错误和PCR扩增中的部分错误，对于样本本身和样本处理过程中引入的DNA损伤假阳性突变，以及PCR早期即引入的错误，UMI是无法修复的。

双链纠错：在UMI标记不同DNA分子的基础上，进一步对每一个DNA的正链和负链进行分别标记。通过这些标记，可以还原原始DNA分子的正链和负链信息。由于DNA损伤和PCR错误同时发生在DNA两条链的同一个位置的几率很小，通过还原同一个DNA的正负链之后，就可以将这些错误过滤掉。因此，双链纠错有能力纠正检测过程中的所有类型的错误。​​​​​​​

MRD检测产品：如何选择？

      *：与组织先验Panel相关