WB实验内参怎么选？

WB（Western Blot）实验是常用的蛋白表达检测技术，选择合适的内参对于WB实验的准确性和可靠性而言至关重要！
 

 

一、什么是内参？

内参，即内部参照（Internal Control），一般是由管家基因编码表达的蛋白，其在多种组织和细胞中表达水平较高，并且表达相对恒定。WB实验中常以内参蛋白的表达作为参照标准，来排除上样量差异、评估实验体系的正常与否以及更准确的比较不同样本/处理之间目的蛋白的表达差异。
 

 

二、为什么要设置内参？

1. 排除上样量差异。WB实验中，在比较不同样本/处理之间目的蛋白的表达差异时，如果上样量不同，无疑会严重影响实验结论的准确性。因此，通过设置内参并确保各泳道间内参蛋白量一致即可排除上样量的影响。
 
2. 排除边界效应。WB实验中，当一次需要检测多个样本而使用较大的凝胶时，凝胶边缘泳道在转膜时效率可能与中间的泳道效率不同。通过设置内参同样可以排除边界效应的影响。
 
3. 检测显色或发光体系是否正常。WB实验中，通过内参信号也可以判定显色或发光体系是否正常工作。
 
4. 比较不同样本/处理之间目的蛋白表达差异。通过设置内参并确保各泳道间内参蛋白量一致，在进行不同样本/处理之间目的蛋白表达比较时会更准确。
 

 

三、如何选择内参？

1.考虑样本种属来源。样本的种属来源不同，内参的选择也是不一样的。如哺乳动物的组织或者细胞，通常选择GAPDH、β-actin、β-tubulin、Lamin B1、Histone H3等。少见物种，通过查阅文献资料或选择高度保守管家基因编码表达的蛋白作为内参。
 
2.考虑细胞定位。内参和目的蛋白最好具有相似的细胞定位。如全细胞裂解液可选择β-actin、β-tubulin等，核蛋白则选择 Lamin B1、Histone H3 等。
 
3.考虑分子量差异。内参分子量需要与目的蛋白有所区别，否则两者条带无法区分。一般目的蛋白与内参分子量至少相差5KDa
 
4. 内参表达不受实验条件影响。
 

 

四、康测科技经验分享

1. 多组织、多细胞样本比较目的蛋白表达时，推荐选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-actin和β-tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性；
 
2. 组织缺氧、糖尿病等因素可能导致细胞中GAPDH的表达增高，此时GAPDH不适合作为内参；
 
3. 涉及细胞增殖的相关实验，c-Jun由于自身表达变化不适合作为内参；
 
4. 凋亡相关实验，TBP、Lamin等也不适合作为内参；
 
5. 检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-actin 和β-tubulin；
 
6. 各种分泌液样本，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参。
 

 

 

 

WB实验中内参的选择必须考虑样本特性和实验条件，祝大家都能做出完美的WB结果。

 
点一下“在看” 再走吧~（右下角）
 

热点推荐

 

 

 

 

 

更多平台

 

bilibili

（长干货科普）

 

视频号

（产品知识分享）

 

小红书

（短干货科普）

 
 

 

关于康测

 

康测致力于先进组学技术的开发和在生物医学研究领域的应用，建立了涵盖基因组学、表观基因组学、转录组学、表观转录组学、免疫组学和互作组学的全面组学服务体系。而在医学检测方面，康测基于自主研发的SMP（Stranded Multiplex PCR）靶向测序技术，可提供检测灵敏度和特异性均为100%的MRD一站式自动化解决方案。
康测提供全面的基因表达调控研究工具
康测提供高度自动化MRD一站式解决方案

 

创建时间：2024-11-19
 本网站由阿里云提供云计算及安全服务
本网站支持 IPv6
Powered by CloudDream