暨南大学&北京大学合作揭示STING和TGF-β信号通路调控γδ T细胞介导的肿瘤免疫
γδ T细胞是干扰素-γ（IFN-γ）的早期来源，在肿瘤免疫中发挥重要作用。环GMP-AMP合成酶（cGAS）催化合成环二核苷酸（如cGAMP），cGAMP进一步激活干扰素基因刺激因子（STING），触发信号级联反应，诱导I型干扰素（IFN-Is）和促炎细胞因子产生，启动抗病毒免疫反应。STING通路在肿瘤免疫监测中十分关键。然而，在肿瘤进展过程中，STING调节γδ T细胞功能的确切机制仍不清楚。
2024年11月，暨南大学尹芝南、郝健磊、陆骊工以及北京大学游富平老师共同通讯在Advanced Science（IF 14.3）上发表了题为“γδ T Cell-mediated Tumor Immunity is Tightly Regulated by STING and TGF-β Signaling Pathways”的研究文章，揭示了STING和TGF-β信号调控γδ T细胞中IFN-γ产生，进而影响γδ T细胞介导的抗肿瘤免疫的作用机制。研究发现，肿瘤衍生cGAMP在肿瘤发展的早期通过诱导TBK1介导的γδ T细胞中Eomes磷酸化来激活STING，STING激活导致IFN-γ的产生和随后的肿瘤监测。然而，在肿瘤进展的晚期，TGF-β表达升高并下调了STING水平，损害了γδ T细胞的功能。此外，TGF-β抑制和STING激动剂之间的协同作用有效地抵消了免疫抑制的肿瘤微环境，从而增强了γδ T细胞的抗肿瘤作用。本研究对开发有效的肿瘤免疫治疗方法具有重要意义。
康测科技为本研究提供ChIP-seq技术服务，进一步验证Eomes是否结合IFN-γ的启动子以响应DMXAA。
一、肿瘤衍生的cGAMP在肿瘤发展早期通过STING-IFN-γ信号激活γδ T细胞
为了研究γδ T细胞介导的抗肿瘤免疫是内在的还是由局部肿瘤微环境所引起，作者比较了原位B16荷瘤小鼠中肿瘤发展早期阶段驻留在淋巴结以及浸润肿瘤微环境的γδ T细胞。作者发现分离自早期肿瘤组织的γδ T细胞（CD45+CD3+γδTCR+）表现出Tmem173、Irf3、Tbk1、Eomes和Ifng表达上调（Figure 1A-C），说明在肿瘤进展的早期阶段γδ T细胞中的STING通路被激活。scRNA-seq显示IFN-γ+ γδ T细胞中STING相关基因（包括Tmem173和Ifng）的表达水平高于IFN-γ- γδ T细胞（Figure 1D,E）。蛋白水平上，早期肿瘤相关γδ T细胞中IFN-γ的表达明显高于淋巴结中的γδ T细胞（Figure 1F,G）。
STING激活是否增强γδ T细胞介导的抗肿瘤免疫？研究表明，外源性STING激活通过IFN-γ增强Vγ4 γδ T细胞的肿瘤杀伤能力，而内源性STING激活在体外/内促进Vγ4 γδ T细胞介导的肿瘤抑制（Figure 1H）。
STING是否影响肺中循环Vγ4 γδ T细胞的肿瘤监测？作者发现，与转移WT Vγ4 γδ T细胞相比，转移了Sting1−/− Vγ4 γδ T细胞的TCRδ−/−+B16小鼠中肿瘤结节数量和肺重增加（Figure 1I,J），这表明Sting1−/− Vγ4 γδ T细胞丧失了显著的肿瘤杀伤功能。此外，RNA-seq显示STING激活可以诱导小鼠γδ T细胞而非CD4+或CD8+ T细胞中全面的I型反应和ISGs。
cGAS催化合成cGAMP，进而激活STING。那么，γδ T细胞中cGAS又发挥怎样的功能？研究表明，γδ T细胞内在的cGAS对于抗肿瘤功能不是必要的，肿瘤衍生的cGAMP以及STING激活对于γδ T细胞介导的肿瘤排斥十分重要。
二、激活的STING信号以TBK1-Eomes依赖性方式促进γδ T细胞中IFN-γ的分泌
作者发现DMXAA（STING激动剂）和cGAMP诱导的γδ T细胞中IFN-γ的表达完全依赖于STING。与树突状细胞和巨噬细胞类似，小鼠γδ T细胞在STING激活后表现出p-STING和p-TBK1的激活（Figure 2A）。但是，DMXAA无法增加TBK1抑制剂amlexanox预处理的Vγ4 γδ T细胞中IFN-γ水平，这意味着TBK1参与STING诱导的IFN-γ产生过程（Figure 2B,C）。
作者还观察到Eomes阳性细胞中IFN-γ被显著诱导（Figure 2D,E），表明Eomes被STING激动剂激活。但Eomes KO γδ T细胞中DMXAA和cGAMP诱导的IFN-γ表达被完全消除（Figure 2F,G）。
TBK1和Eomes之间是否存在相互作用？Co-IP表明DMXAA处理的γδ T细胞中内源性Eomes和TBK1直接结合（Figure 2H）。使用抗Eomes抗体在Vγ4 γδ T细胞中进行免疫沉淀，随后进行质谱分析。作者注意到DMXAA处理后，Vγ4 γδ T细胞中Eomes Ser617位点发生磷酸化（Figure 2I-K）。荧光素酶实验证明Ser617位点突变会消除DMXAA对IFN-γ的诱导（Figure 2L），提示Eomes Ser617位点的磷酸化是IFN-γ的转录激活所必需的。作者利用ChIP-seq进一步验证Eomes是否结合IFN-γ的启动子区以响应DMXAA。结果表明，DMXAA或cGAMP处理后，Vγ4 γδ T细胞中Eomes而非T-bet与Ifng启动子结合（Figure 2M），DMXAA增强了Eomes与Ifng启动子的结合（Figure 2N）。总之，γδ T细胞中激活的STING信号以TBK1-激活的Eomes依赖性方式促进IFN-γ的分泌。
三、STING-IFN-γ轴介导抗肿瘤免疫并抑制人Vδ2 γδ T 细胞耗竭
作者进一步探究了STING-IFN-γ信号在人Vγ9Vδ2 γδ T细胞中的作用。研究显示diABZi-C3（STING激动剂）或cGAMP处理人Vγ9Vδ2 γδ T细胞，激活STING后诱导IFN-γ产生（Figure 3A,B）。作者观察到STING激活后p-STING和p-TBK1被激活（Figure 3C）。RNA-seq揭示人 Vδ2 γδ T细胞中STING激活后IFNG、TBK1和NFKB表达上调而耗竭标志物PDCD1和TOX1以及TGF-β受体家族TGFR1和TGFR3受抑制（Figure 3D-H）。
STING激活是否促进人γδ T细胞的抗肿瘤功能？研究发现，接受diABZi-C3预处理Vγ9Vδ2 γδ T细胞的小鼠表现出显著增强的抗肿瘤活性（Figure 3J,K）。人Vγ9Vδ2 γδ T细胞在STING激活后表现出对肿瘤进展的显著抑制，这些结果强调了STING-IFN-γ轴在介导人Vδ2 γδ T细胞的抗肿瘤功能中的重要性。
四、TGF-β和STING通路在肿瘤进展过程中呈负相关
肿瘤发展的早期阶段STING-IFN-γ通路被激活，肿瘤如何逃避这种响应？作者首先假设γδ T细胞中STING表达降低与癌症进展有关。结果显示，肺癌患者Vδ2 γδ T细胞中STING表达显著低于健康供体（Figure 4A,B）。肺癌患者Vδ2 γδ T细胞中IFN-γ水平同样降低（Figure 4C,D），并且diABZI-C3诱导的IFN-γ产生严重受损（Figure 4E）。据报道，TGF-β下调STING的表达，但对cGAS或cGAMP水平的影响有限。作者发现IV期肿瘤组织中γδ T细胞较少且STING水平低，而I期肿瘤组织中γδ T细胞较多且STING水平高（Figure 4F,G）。相反，与I期肿瘤组织相比，IV期肿瘤组织中TGF-β1表达上调（Figure 4F,H）。总之，随着肿瘤进展，TGF-β1表达上调而STING表达降低。
五、小鼠模型肿瘤进展阶段，γδ T细胞中STING-IFN-γ信号受损
作者进一步评估了小鼠模型中STING表达水平和γδ T细胞的功能状态。作者发现肿瘤进展过程中肿瘤浸润γδ T细胞的数量减少（Figure 5A,B）。此外，随着肿瘤进展，这些肿瘤浸润γδ T细胞在肿瘤组织中表现出STING表达降低（Figure 5C,D）以及p-Smad2上调（Figure 5E,F）。肿瘤浸润γδ T细胞中IFN-γ表达降低（Figure 5G,H），而肿瘤组织中活性TGF-β1的表达上调（Figure 5M）。
TGF-β如何影响γδ T细胞中IFN-γ产生和STING水平？TGF-β1处理的γδ T细胞中IFN-γ和p-STING水平下调（Figure 5N-Q）。Sting1−/− γδ T细胞中IFN-γ水平不受TGF-β1影响（Figure 5R,S），证明STING信号参与TGF-β1对IFN-γ的表达抑制。随后，作者探究了TGF-β介导的STING-IFN-γ下调的潜在机制，并重点关注Sting1启动子的甲基化。通过将DNA甲基转移酶抑制剂DAC（decitabine, DNMTi）添加到TGF-β处理的γδ T细胞培养物中，作者发现DAC处理后，TGF-β丧失下调STING以及抑制cGAMP介导的IFN-γ产生的能力（Figure 5T-W）。因此，TGF-β可能通过甲基化依赖性机制下调γδ T细胞中的STING水平。
六、γδ T细胞中TGFβR阻断提高了STING激动剂在晚期肿瘤免疫治疗中的疗效
考虑到晚期肿瘤中TGF-β水平升高以及γδ T细胞中STING表达下调，作者探究了结合TGF-β抑制和STING激活在γδ T细胞介导的晚期肿瘤免疫治疗中的潜在应用。研究表明，单独使用cGAMP治疗不会改变肿瘤生长（Figure 6B,C），意味着在晚期肿瘤中STING对于γδ T细胞的抗肿瘤功能不像早期那样“重要”。但是，结合TGF-β1R信号阻断和cGAMP治疗可以显著控制肿瘤生长（Figure 6B,C），这也证实肿瘤进展后期，水平升高的TGF-β劫持了γδ T细胞效应器功能。
Jing Luo, Shengli Wang, Quanli Yang, et al. γδ T Cell-mediated Tumor Immunity is Tightly Regulated by STING and TGF-β Signaling Pathways[J]. Advanced Science, 2024
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