当qPCR与转录组测序结果“打架”，真相究竟是什么？
在基因表达研究中，qPCR与转录组测序的结果不一致常常让人困惑。近期，我们协助一位客户深入排查了基因A的表达差异争议，最终发现：看似矛盾的结果背后，实则是技术视角的互补。以下是事件全程解析，也借此传递我们的服务理念——用专业和耐心，守护每一份数据的真实价值。
一、事件背景：基因A的“表达量之谜”
客户通过我司完成了一项UMI（unique molecular identity，唯一分子标签）转录组测序项目，样本包含3个野生型（WT）和3个敲低（KD）细胞系。测序分析显示，目标基因A在两组间表达量无显著差异（表1），但后续的qPCR验证却表明，KD组的基因A的表达量显著下调。这一矛盾引发了客户的疑虑：究竟是测序数据不可靠，还是实验环节存在误差？
表1. 转录组测序中基因A表达量（FPKM）
二、数据复盘：抽丝剥茧，寻找真相
我司技术团队迅速响应，与客户共同展开以下排查：
1. qPCR数据验证：局部区域表达显著下调
客户提供的qPCR引物针对基因A的某段87 bp区域。数据显示，该区域KD组的表达量显著低于WT组（表2），与客户预期一致。
表2. qPCR验证基因A表达
Fold change=2-ΔΔCt=2-(5.34-3.60)=2-1.74=0.29
KD组基因A的表达量仅为WT组的29%（Fold Change=0.29），敲低效果很明显。
2. 转录组测序复盘：全局视角揭示“补偿效应”
通过UMI校正的测序数据发现：
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在qPCR引物靶向的87 bp区域，KD组reads数确实显著低于WT组（表3、图1），与qPCR结果吻合。
表3. qPCR区域的reads count
图1. qPCR区域reads分布
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但在基因A全长（>150 kb）的部分其他区域，KD组reads数却明显高于WT组（图2）。
图2. 部分其他区域reads
关键结论：基因A在敲低后，可能因可变剪切或转录本稳定性变化等原因，导致不同区域的表达量呈现“此消彼长”的现象。而qPCR仅检测局部区域，转录组测序则覆盖基因全长，两者视角不同，最终形成“矛盾假象”。
三、技术解析：为何UMI转录组测序更值得信赖？
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UMI技术优势：通过唯一分子标签校正PCR扩增偏好性，显著提高定量准确性。
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全局覆盖性：qPCR依赖引物设计位置，可能受局部异构体影响；而测序数据可全面反映基因全长的表达动态。
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数据可追溯性：原始reads和IGV可视化结果均可复核，确保结论透明可信。
四、我们的承诺：以专业为盾，以耐心为矛
此次事件中，客户最初认为数据矛盾，但通过深入分析，我们证明了：
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UMI转录组测序结果真实可靠；
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技术间差异可通过多维度数据交叉验证解释。
我们始终相信：数据争议不是终点，而是科学探索的起点。无论结果是否符合预期，我们承诺：
✅ 第一时间响应问题，提供原始数据与可视化证据；
✅ 联合生物信息、实验技术团队多角度排查；
✅ 用通俗易懂的方式解读数据，助客户拨开迷雾。
五、致客户：信任是相互的，真相是唯一的
基因表达调控复杂多变，技术手段各有千秋。我们珍视每一份托付，也期待与您共同成长。
当数据出现“矛盾”时，请放心交给我们——因为答案，永远藏在更专业、更耐心的追寻之中。
关于我们
武汉康测科技公司专注高通量测序与多组学分析，提供从实验设计、生信分析到结果验证的一站式解决方案。关注公众号，获取更多案例解析与技术干货！
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康测科技致力于先进组学技术的开发和在生物医学研究领域的应用，建立了涵盖基因组学、表观基因组学、转录组学、表观转录组学、免疫组学和互作组学的全面组学服务体系。而在医学检测方面，康测科技基于自主研发的SMP（Stranded Multiplex PCR）靶向测序技术，可提供检测灵敏度和特异性均为100%的MRD一站式自动化解决方案。
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